亜鉛探訪No.030

ｱﾙｶﾘﾌｫｽﾌｧﾀｰｾﾞと亜鉛

『亜鉛探訪030』へようこそ！

1. はじめに

亜鉛は、細胞内の多様な反応に関与する必須微量元素であり、その生体内での役割は計り知れません。今回、亜鉛探訪では、最初に発見された亜鉛酵素『アルカリフォスファターゼ(以下ALPと略します)』に焦点を当て、その構造と機構を解説します。

2. 発見とその意義

ALPは、活性部位に金属イオンが密接に配置されていることが明らかとなったことで、酵素の触媒作用における金属の役割を再評価するきっかけとなりました。
この発見は、亜鉛が単なる補助因子ではなく、酵素活性の核心を担っていることを示しています。

3. 構造の詳細

ALPの活性部位には、2つの亜鉛イオンと1つのマグネシウムイオンが存在し、その中心間距離はZn1–Zn2が3.9Å、Zn2–Mg3が4.9Å、Zn1–Mg3が7.1Åと非常に精密に配置されています。
また、Asp51のカルボキシル基がZn2とMg3を橋渡しする唯一のリガンドとして働いている点が、構造の特徴として挙げられます。

4. 触媒機構

2.0Åの解像度で得られた非共有リン酸複合体の結晶構造から、Zn1とZn2の間にリン酸ブリッジが形成され、Arg166のグアニジニウム基との水素結合が、複合体の安定性に寄与していることが示されました。
この配置により、リン酸加水分解に際して、リン酸化されるSer102が求核攻撃(注1)を開始するための適切な位置に配置されることが確認されました。
さらに、Zn1およびZn2は、エステル酸素を配位して離脱基の活性化を促進し、反応過程の二段階の置換反応が解離性を帯びる可能性を示唆しています。
反応の律速段階は、アルカリ性条件下でのリン酸の解離（35 s⁻¹）であり、この点が触媒機構全体の重要な鍵となっています。
(注1)求核攻撃とは、電子を豊富に持つ求核剤が、電子が不足している求電子部位に向かって接近・反応し、新たな化学結合を形成する反応機構のことで、ALPにおいては求核剤（例：Zn1に配位した水分子やヒドロキシド）がリン酸エステルに対して攻撃を行い、リン酸転移反応を促進する役割を果たしています

5. 類似酵素との比較

興味深いことに、セレウス菌由来のホスホリパーゼC(注2)やペニシリウム・シトリナム由来のP1ヌクレアーゼ(注3)においても、同様の三核亜鉛部位(注4)が確認され、これらの酵素間で亜鉛の触媒機能が共通していることが分かりました。
この共通構造は、異なるリン酸エステル加水分解反応においても、亜鉛が重要な触媒役割を担うことを裏付けています。
(注2)細胞膜に存在するリン脂質を加水分解する酵素で、外部からの刺激を細胞内の多様な反応へと変換する、極めて重要な酵素です。
(注3)核酸の加水分解を行うエンドヌクレアーゼで、核酸の構造を変化させたり、不要な核酸断片を分解するための重要な酵素として機能しています。
(注4)触媒反応を進行させるために、３つの金属イオンが非常に近接して配置された構造的モチーフを指します。

6. ALPの機能

リン酸エステルの加水分解

生体内の各種リン酸エステルを加水分解し、リン酸とアルコール（または対応する基）に分解することで、代謝の調整やエネルギー供給に寄与します。

骨のミネラリゼーションの促進

組織非特異的ALP（TNAP）は、骨や歯の形成においてカルシウムとリンの沈着を助け、適切な骨格形成に必要な無機リンを供給します。

胆汁排出の指標

肝臓由来のALPは、胆汁の流れに関連しており、血中濃度の上昇が胆汁うっ滞や肝疾患の診断マーカーとして利用されます。

腸内での解毒作用

腸型ALPは、細菌由来のリポ多糖（LPS）などの有害物質を不活性化することで、腸内の免疫調節と炎症抑制に寄与します。

リン酸代謝の調整

血中および細胞外のリン酸濃度を調整することにより、エネルギー代謝や細胞内シグナル伝達に影響を与えます。

細胞外ATPの分解によるシグナル調節

細胞外に放出されたATPやADPを分解し、最終的にアデノシンに変換することで、パルキンエーター受容体などを介した細胞シグナリングに関与します。

免疫応答の調整

炎症性物質の不活性化やリン酸供与体の除去を通して、局所的な免疫反応や炎症プロセスを調節します。

細胞分化および発生過程への関与

発生初期や組織再生時において、細胞間のシグナル伝達を調整し、適切な細胞分化や組織形成をサポートします。

細胞膜や細胞外マトリックスのリモデリング

細胞表面や周囲のマトリックス中のリン脂質・リン酸化タンパク質の修飾を通して、細胞の接着性や移動性に影響を与える可能性があります。

腎臓におけるリン酸再吸収の調節

腎臓型ALPは尿中のリン酸の再吸収過程に関与し、体内のリン酸バランスを維持する役割が示唆されています。

肝再生の促進

肝臓でのALPの活性は、肝細胞の再生や修復過程にも寄与している可能性があります。

血管新生への関与

一部の研究では、ALPが血管内皮細胞の増殖や新生血管形成に影響を及ぼす可能性が報告されています。

エネルギー代謝の補助

リン酸の供給と除去のバランスをとることで、ATP合成やその他のエネルギー関連反応を支えます。

神経細胞でのシグナル伝達調整

神経系において、ALPが神経伝達物質や受容体のリン酸化状態を調整し、シグナル伝達に関与する可能性があります。

病態マーカーとしての役割

ALPの血中濃度は、骨疾患、肝疾患、胆道閉塞、さらには心血管疾患など、さまざまな病態の診断・評価に利用されます。

7. まとめ

ALPの詳細な構造解析と触媒機構の解明、その機能の分析は、亜鉛酵素の生化学的、生理学的理解を大きく前進させる成果となりました。
今後は、これらの知見を基に、亜鉛が関与する他の酵素反応や、亜鉛代謝の調節メカニズムの解明が期待されます。

参考文献2

タイトル　

小児期の臨床におけるアルカリホスファターゼ：くる病を中心に

文献

Front Endocrinol (Lausanne). 2023 Feb 2:14:1111445.

抄録

血清アルカリホスファターゼ（ALP）とそのアイソザイムは骨代謝を反映する： ALPは全身的に無機リン酸とピロリン酸の比率を高め、ミネラル形成を促進すると同時に、ミネラル形成の阻害因子である細胞外のピロリン酸濃度を低下させる。
逆に、ALP活性が低いと、骨のターンオーバーが低下する。 ALPには、組織の発現部位に応じて4つのアイソザイムがある：腸ALP、胎盤ALP、生殖細胞ALP、組織非特異的ALPまたは肝臓/骨/腎臓ALP。骨アイソザイム（B-ALP）は骨石灰化に関与し、骨芽細胞活性の結果としての骨回転のマーカーである。
くる病の最も一般的な原因はビタミンDの栄養欠乏である。
この総説の目的は、くる病の診断と治療に関連するマーカーとしてALP血清濃度が果たす役割について最新の情報を提供することである。
くる病の診断は、臨床的、放射線学的、検査学的特徴に基づいて行われる。 ALP値の上昇は、小児のくる病の診断マーカーの一つであるが、骨形成過程とも関連している。 ALPは、臨床的、検査学的特徴から、くる病とくる病に類似した他の疾患との鑑別にも有用であり、他の生化学的マーカーとともに、異なる病型のくる病の鑑別診断に極めて重要である。くる病の年齢、重症度、罹病期間もALPの上昇を調節する可能性がある。最後に、ALP測定は臨床および治療経過観察に有用である。

参考文献1

タイトル　

アルカリホスファターゼの構造と機構

文献

Annu Rev Biophys Biomol Struct. 1992:21:441-83.

抄録

アルカリホスファターゼは、3つの金属イオン（2つのZnイオンと1つのMgイオン）が活性中心に存在する、最初に発見された亜鉛酵素である。
また、3つの部位すべてに亜鉛イオンが存在することで、酵素の活性が最大になる。これらの金属イオンの中心間距離は3.9A（Zn1-Zn2）、4.9A（Zn2-Mg3）、7.1A（Zn1-Mg3）である。これらの金属中心が密接にパッキングしているにもかかわらず、1つの橋渡し配位子、Asp51のカルボキシルだけがZn2とMg3を橋渡ししている。
活性中心で形成された非共有結合リン酸複合体E.Pの2.0Å分解能の結晶構造から、2つのリン酸オキシゲンがZn1とZn2の間でリン酸架橋を形成し、他の2つのリン酸オキシゲンはArg166のグアニジウム基と水素結合を形成していることがわかった。これにより、リン酸加水分解中にリン酸化されることが知られている残基であるSer102が、リンへの求核攻撃を開始するのに必要な先端位置に配置される。 E.Pの構造を酵素-基質複合体E.ROPO4(2-)に外挿すると、Zn1はエステル酸素を配位する必要があり、その結果Ser102のリン酸化における脱離基を活性化するという結論になる。
同様に、Zn2はセリルリン酸のエステル酸素を配位し、ホスホセリル中間体の加水分解の際に脱離基を活性化するようである。
これらの発見は、アルカリホスファターゼによって触媒されるリン酸の2つの置換には、それぞれ重要な解離性があることを示唆している。ホスホセリル中間体の形成後、Zn1に配位する水分子（または水酸化物）が、メカニズムの第2段階における求核剤となるようである。 E.P中間体からの生成リン酸の解離は、アルカリ性pHでは35秒-1と最も遅く、従ってこの機構の律速段階である。
アルカリホスファターゼの最初の結晶構造が決定されて以来、リン酸エステル加水分解に関与する酵素の他の2つの結晶構造が完成した。これらの酵素はBacillus cereus由来のホスホリパーゼC（1.5Å分解能の構造）(43)とPenicillium citrinum由来のP1ヌクレアーゼ（2.8Å分解能の構造）(74)である。どちらの酵素もホスホジエステルを加水分解する。ホスホリパーゼCの基質はホスファチジルイノシトールとホスファチジルコリンであり、P1ヌクレアーゼは一本鎖のリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドを加水分解するエンドヌクレアーゼである。 P1ヌクレアーゼはヌクレオチドの3'-末端リン酸に対するホスホモノエステラーゼとしての活性も持つ。両酵素のZnイオンはほとんど同じ三核部位を形成する。